一、AFM和拉曼显微镜联用的意义

AFM 揭示了纳米尺度上的结构(地形)和机械信息(例如，刚度或杨氏模量，粘度，局部粘附力) ，与拉曼显微镜在亚微米尺度上提供的化学信息相互补充。因此，使用这两种方法给出了一个相当完整的图片和更好的理解生物系统。两者的结合使得在纳米尺度上揭示化学成分的机会增加，如图1和表1所示。

图2 表面探针显微镜与拉曼光谱学相结合的操作原理。

使用传统的共焦拉曼显微镜可以获得最好的可解释的化学信息，但是空间分辨率受到光的衍射的限制。近场拉曼显微镜和针尖增强拉曼光谱学(TERS)克服了这个限制，但是在复杂的生物系统中操作起来更加困难。原子力显微镜(AFM)提供了纳米尺度上的结构和力学信息，因此与拉曼显微镜相结合是揭示结构-功能关系的重要工具。

表一 不同拉曼-原子力显微镜工作模式的特性

二、AFM和Raman显微镜联用的实现方法

集成原子力显微镜和拉曼(共同定位，或称为联用)在2000年代初首次成为可能。市场上的几种装置能够实现AFM-Raman的共定位; 其中一些装置允许两种方法同时工作。当原子力显微镜在顶部扫描时，拉曼效应是从样品的底部(底部照明)获得的；这种方法需要使用一个大数字孔径的物镜，只能对透明样品进行测量。在顶部照明，另一种没有这么理想的方案是，使用特殊形状的原子力显微镜的针尖，使激光能够从顶部的穿过针尖区域激发样品。然而，用近红外光照射悬臂梁(例如，785nm)也会在一定程度上影响 AFM 扫描(由于悬臂梁加热)。在顶部照明结构中也可能发生尖端的遮蔽效应，从而影响远场拉曼信号。为了克服阴影效应，当 AFM 扫描运行时(侧面照明) ，也可以从侧面采集信号。一般来说，从侧面收集到的信号强度较低，而且是倾斜的(只从一个特定的角度) ，还需要优化获得最佳的激励和收集角度。由于 AFM的探针架和悬臂需要一定的操作空间，顶部和侧面照明的布置通常只允许使用具有较高的工作距离的、相对较低的放大率(20X或50X)的光学物镜(通常数字孔径不高于0.5)。这大大降低了拉曼图像的空间分辨率。

然而，大多数AFM-Raman的联用仪器中，AFM和拉曼光谱仪是依次工作的。高分子科学是最早受益于联用测量的学科之一，这种方法原理的演示可以在相关文献(Schmidt 等人，2005)中找到。经过20年之后，它在生物科学/材料中的应用只有很少的例子出现。生物材料的“敏感”特性及其异质性给这两种方法在原位的同时测量增加了难度。为了完成 AFM 测量和拉曼成像，许多生物材料需要专门进行样品的准备或固定。

三、原子力显微镜与拉曼光谱的结合: 从医学到新能源

结合结构和化学数据揭示了帕金森病过程中 α-突触核蛋白聚集(原纤维形成)的构象变化(Apetri 等，2006)。仔细观察拉曼酰胺 I 和 III 带以及形貌信息，可以得出这样的结论: 具有 α-螺旋二级结构的低聚物聚集，经历一个构象改变，这可能是控制纤维化过程动力学的一个步骤。拉曼显微镜的一个优点是，对于分析样品的大小或形状(在溶液中吸附)没有限制。用显微拉曼光谱和原子力显微镜研究了在铀表面生长的氧化亚铁硫杆菌生物膜中产生的胞外聚合物，虽然其拉曼光谱(组成)没有差异但却发现了不含铀的细菌(Pradhan 等，2008)。该方法不仅限于细菌细胞，而且可以成像粘附的真核细胞。通过记录每个组分的拉曼图和校准模型并用 AFM 提供的形貌图像校正焦点效应，已经对不同细胞进行了 RNA，DNA 和蛋白质的定量分析(Boitor 等，2015)。此外，评估化学修饰(取代)或机械过程(研磨，扁平化)可结合两种技术进行研究。某些应用改性的穿透深度往往不均匀分布，因为它取决于要改性的颗粒或表面的直径或厚度。Wetzel 等人(Wetzel，2010)探讨了这一现象，他们用疏水辛烯基琥珀酸酯交换蜡质玉米淀粉颗粒的羟基以达到相称的乳化功能。通过拉曼显微镜结合数据聚改性颗粒的特性。对纤维素的碱处理也用同样的方法进行了研究(Eronen 等，2008)。

在医学上，这种方法的结合也被用于研究药物之间的相互作用及其在载体中聚集的敏感性。考虑到推进剂介质和药物之间的力距曲线的粘合特性，可以优化配方(Rogueda 等，2011)。同样，通过共定位的 AFM-Raman (Biggs 等，2012) ，也观察到从载体聚合物基质体外释放药物过程中孔网络的形成。此外，金属纳米粒子的催化反应也得到了该技术的证实(Harvey et al，2012)。在这种情况下，金属纳米粒子增强了拉曼信号。AFM 和(共聚焦)3D-Raman 在小鼠主动脉的血管壁(Pilarczyk 等，2014) ，肿瘤细胞(Lau 等，2014)和动脉中的动脉粥样硬化斑块(Marzec 等，2014)。主动脉内皮和动脉粥样硬化斑块的决定性成分如弹性蛋白或富含脂质的区域的化学和机械特征不需要耗时的免疫组织化学或染色就可以得到。通过结合细胞器和脂质结构域所占体积的数据，可以更好地了解肿瘤的进展类来监测改性的空间分布，而 AFM 相位和形貌图描述了改性的位置和功能特征细胞的刚性。

    此外，研究新的发电方法也可以从这些方法中受益。在滞后期和指数生长期，通过 AFM 共振拉曼光谱学监测阳极生长的地杆菌/硫还原菌(Lebedev et al，2014)。测量结果表明，在其生长的滞后和指数阶段分别产生低电流和高电流的转变有关

四、案例研究: AFM-Raman联用研究纤维素-木质素薄膜

   前沿研究不仅要描述生物样品，而且要揭示重要的结构-功能关系；不仅要对不同结构成像，而且要获得最感兴趣的力学性能。很少有例子关注 AFM 揭示样品的力学性质并与拉曼图像相关联，从而得到其化学信息。结合这两种方法，对纤维素和木质素薄膜进行了研究。这是地球上最常见的聚合物，它们与其他聚合物(半纤维素、果胶)一起构成了植物细胞壁的层次结构，从而形成了植物的所有生物量。研究它们的力学性质以及它们之间的相互作用对于理解在整个组织或植物中起作用的成分以及它们在新型纳米复合材料中的应用是非常重要的。

图3共聚焦拉曼显微镜(CRM)和原子力显微镜显微镜(AFM)的个案研究。

(A)分布于石英玻璃上的纤维素纳米晶(CNCs)和木质素脱氢聚合物(DHP)薄膜的 AFM 形貌图像。(B)在1600cm-1(木质素)(红色)和380cm-1(蓝色)的主芳香伸展带上基于带整合的伪彩色图像。(C)材料科学和其他领域中红色(木质素团聚)和蓝色(富含纤维素)区域的平均拉曼光谱。

图4木质素脱氢聚合物(DHP)团聚体上的高分辨率数字脉冲力模式(DPFM)的AFM图像。

DPFM 中的 AFM 图像显示(A)地形和不同的力学性能: (B) Fmax (尖端和样品之间的最大力) ，(C)局部粘附和(D)刚度。

五、结论

在过去的几十年里，拉曼光谱学已经证明了它与其他技术结合的可行性。所获得的化学信息与原子力显微镜(AFM)提供的机械/形貌图像是互补的。它们在 TERS 或近场拉曼中的结合具有监测纳米尺度化学变化的很大潜力。然而，TERS 有一些需要解决的缺点: 在进行这些方法时，尖端制造和重复性是主要关注的问题，以及样品制备(理想的薄、深度均匀和透明)和具有不同波段(增强效应)的低信号拉曼光谱通常难以解释。事实上，世界上只有少数 TERS 专业小组进行了成功的测量，这是一个迹象，它还不是一种直接可用、适用于每一个感兴趣的生物样本的方法。共定位拉曼和原子力显微镜，尽管拉曼横向分辨率低于 TERS，但是它有很高的潜力，因为它提供了监测样品力学性质和揭示结构-功能关系的可能性。如果衍射有限的空间分辨率不足以获得化学信息，近场拉曼也是一种选择。尽管如此，人们还是不得不面对微弱的拉曼信号和来自样品方面的限制等问题。

资料来源：

Batirtze Prats-Mateu and Notburga Gierlinger. Tip in–light on- Advantages, challenges, and applications of combining AFM and Raman microscopy on biological samples. Microscopy Research and Technique 2017, 80: 30-40